Identification of Genes Potentially Associated with the Fertility Instability of S-Type Cytoplasmic Male Sterility in Maize via Bulked Segregant RNA-Seq
发表杂志:PLOS ONE
发表日期:2016-9-26
合作单位:北京农林科学院

研究背景:

细胞质雄性不育(CMS,花粉不育但雌蕊能正常发育)是高等植物中的常见现象,表现为母系遗传。CMS广泛应用于作物杂交育种,以避免额外的人力物力去人工去雄,因此,CMS具有重要的理论和商业价值。植物CMS是由核线粒体相互作用介导的,不育性状的产生来自线粒体基因的表达,但不育性状可以通过核恢复育性基因得到恢复,产生育性部分恢复的表型。目前造成育性不稳定的遗传修饰的分子机制仍然不清楚。本研究欲通过BSR的策略寻找引起玉米育性不稳定的候选基因。

材料选取:

Jing724和 MD32(CMS-S:S型细胞质雄性不育系)为亲本,杂交得到F1群体,再以Jing724为回交亲本,构建BC4群体,群体大小462。选取BC4群体中极端30个完全雄性不育植株的花粉,分别提取RNA,并等量混合构建不育池S,同理选取30个育性部分恢复植株的花粉,构建育性部分恢复池F。
测序平台:Illumina HiseqTM2500,PE125
测序数据:150M clean reads

主要结果:

1、育性分析:FIL-B(育性不稳定系)分为育性部分恢复的植株和完全不育植株,本项目所构建的BC4群体462个子代中有14.9% 的植株为育性部分恢复的表型。育性部分恢复植株的花粉大小小于正常花粉,大于完全不育植株的花粉(Fig 1.)。经I2-KI染色后的不育花粉表现出形态的不规则和染色的异常(Fig 2.)。

 

Fig 1. FIL-B花粉展示

A:Jing724 和FIL-B (育性不稳定系,包括育性部分恢复植株和完全不育植株) 在抽穗6天后的穗;B: A图中各植株穗上的花粉. 其中红色的标尺代表 3 cm

Fig 2. I2-KI染色后的花粉

A: 正常花粉; B: 育性部分恢复花粉;C:不育花粉

 

2、显微镜下观察花粉小孢子:在育性部分恢复的植株中只有一部分的小孢子呈现在正常形态,而在不育植株中无正常形态小孢子。(Fig 3。)

Fig 3. 花粉小孢子的显微观察
A: 正常花粉; B: 育性部分恢复花粉;C:不育花粉

 

3、混池间差异基因分析:本项目以B73为参考基因组,将F池和S池获得的89M和61M clean reads进行比对。F池和S池的唯一比对效率为72。79% 和69。17%,表达的基因数目分别为31,905和31,895。获得混池间的差异基因数目3,672个,在F池中上调表达的有3548个,下调表达的有124个,这些基因共3540个通过NR, Swiss-Prot, GO, COG和 KEGG数据库得到注释。

4、BSR关联分析:与参考基因组比对后,F池和S池分别获得171,594和 170,820个 SNP,选取混池间差异的SNP位点,进行ED关联分析,共得到5个候选区域(Fig 4.),结合数据库注释结果及转录组差异基因的结果,最终获得12个候选基因(Table 2、Table 3)。

 

 

Fig 4. ED关联分析结果图
A: 各染色体上SNP的ED值; B: 2号染色体上SNP的ED值;C:各染色体上SNP经拟合后的关联分析结果;B: 2号染色体上SNP经拟合后的的关联分析结果,其中红色的虚线代表阈值线(99百分位法计算得到),黑色的实线代表拟合曲线

5、关联基因的qPCR验证:
本研究选取6个与蛋白相关的候选基因,通过qPCR的方法验证RNA-seq结果。研究发现在育性部分恢复和不育两种表型中,这6个候选基因出现4-8倍不同水平的差异表达。

Fig 5. qPCR验证结果

6、KASP验证:
本研究选取BC4群体中50株育性部分恢复植株和50株不育植株,分别提取DNA,对候选的两个蛋白基因共4个SNP位点进行KASP验证,发现在不同的表型下会出现不同的基因型,再次暗示这两个基因很可能是与育性不稳定相关。

Fig 6. KASP验证结果

文章亮点:

1、研究性状雄性不育在育种工作中具有重大意义,算得上热点研究。
2、BSR定位结果准确:转录组BSR不仅能实现SNP水平的定位,同时能从基因的差异表达水平进一步缩小候选范围,定位结果相对精细。
北京赛车pk10投注 3、验证内容丰富:从RNA水平(qPCR)和DNA水平(KASP)验证,只为拿到候选基因。

参考文献:

Su A, Song W, Xing J, et al。 Identification of Genes Potentially Associated with the Fertility Instability of S-Type Cytoplasmic Male Sterility in Maize via Bulked Segregant RNA-Seq[J]。 PloS one, 2016, 11(9): e0163489。

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