自1977年Sanger发明了双脱氧链终止法测序技术以来,新的测序技术、测序平台不断涌现。目前,三代测序技术已凭借其技术优势受到越来越多科研工作者的青睐。三代测序技术集长读长和高通量于一身,对高纯度、长读长核酸分子进行实时测序,此技术已广泛应用于科学研究及精准医疗中。三代测序的代表为Oxford Nanopore Technologies(ONT)和PicBio(PB)这两大测序平台,下面就这两个平台与大家说道说道:

测序原理

ONT测序将人工合成的一种多聚合物的膜浸在离子溶液中,多聚合物膜上布满了经改造的穿膜孔的跨膜通道蛋白(纳米孔),也就是Reader蛋白,在膜两侧施加不同的电压产生电压差,DNA链在马达蛋白的牵引下,解螺旋通过纳米孔蛋白,不同的碱基会形成特征性离子电流变化信号,通过对这些信号的检测,得到碱基序列,完成测序。

PB的测序空间为ZMW(zero-mode wave guides,零模波导孔),外径100多纳米,DNA分子掉入孔中,不同荧光标记的脱氧核苷酸在聚合酶的作用下,会产生不同的荧光信号,随后标记基团自动脱落,维持了信号的持续监测。激光从ZMW底部打入,由于孔直径很小而不能穿过孔进入上方溶液区,从而把背景噪音降到最低。

由此,ONT的纳米孔是指膜上的纳米孔通道蛋白,PB的纳米孔为ZMW孔,在“方寸之地”完成测序。

PB测序

ONT测序
测序仪器

ONT平台:MinION、GridION X5、PromethION;具体区别如下:

PB平台:RSII和Sequel系列仪器,目前Sequel系列平台测序通量高、单Gb数据成本低、周期短的特点已将RSII平台取代。

2平台发展前景!

ONT平台在软、硬件及建库技术等各方面不断升级优化,如推出的R10测序芯片,将单碱基电流信号判读率提升到2次,数据质量方面将会有了明显改善,由于小编未有足够的实测数据,目前就不做分享了。

目前PacBio推出Sequel II测序平台,其单张芯片测序通量较Sequel平台提升了8倍左右。

建库方式

ONT平台:在DNA测序方面,利用片段筛选,非片段筛选和片段打断3种方式对DNA样品进行1D建库。

北京赛车pk10投注片筛即利用Bluepippin对DNA样品进行片段筛选,并依据科研人员的实际研究需求梯度富集回收大片段用于建库测序。非片段筛选即DNA提取后,未经过片段筛选的过程,直接进行建库测序。片段打断即利用g-TUBE将DNA片段打断成20kb或其它大小的片段,这种技术在一定程度上可提升单cell产量,其可应用于个体重测序、甲基化等研究。倘若您想组装基因组,小编还是建议使用片段筛选的方式,富集大片段进行建库测序,经过片段筛选后,会有更大比例的长片段DNA分子穿过纳米孔,这样得到的测序读长数据相较于其它建库方式会普遍变长。

PB平台:在DNA测序方面,PB一般使用g-TUBE将DNA片段打断成20kb或30kb的文库,对打断的DNA样品进行末端修复,连接哑铃型的接头,使用Bluepippin进行片段筛选,获得测序文库。

北京赛车pk10投注以ONT的片筛文库和PB的文库比较,由于PB经过了片段打断,且受DNA聚合酶活性的影响,在读长方面稍逊色于ONT平台。以下就对它俩的测序数据做一比较。

测序数据

数据读长比较,后3列依次是Read_N50,平均长度和最长reads大小,单位都是bp哦。。。。

以某物种为例,我们看看各片段的分布:

总结:从这份数据可以看出,PB 平台18K以上的数据占39.6%,Nanopore平台20K以上的数据可达68%。

数据纠错

ONT平台和PB平台下机数据的准确率一般85%左右,后期Canu软件进行Reads纠错,应用Reads间去比对最长的Reads(一般后期应用30-50×的数据用于基因组组装),数据的准确率有了大幅度提升。ONT平台应用smart、Canu、wtbdg等 3款软件进行组装,racon两轮纠错(三代数据),pilon三轮纠错(2代数据)后,可将基因组的准确率提升至99.99%。PB平台一般应用smart、Canu、wtbdg、Falcon 4款软件进行组装,arrow纠错(三代数据),pilon三轮纠错(2代数据)后,可将基因组的准确率提升至99.999%。

总述

PB、ONT各有千秋,各具特色。目前百迈客已完成三代测序平台的完整搭建,并集提取、建库、测序于一体,可满足科研工作者的不同测序需求;

 

 

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