研究背景

环状RNA(circRNA)是一类知之甚少的非编码RNA,其中一些已被证明对细胞增殖和发育具有功能重要。CircRNA主要来自编码mRNA的反向剪接事件,使得难以区分circRNA与线性剪接的mRNA的内部外显子组成。为了检查circRNA的全局外显子组成,作者使用纳米孔技术对人和小鼠脑源RNA进行了单分子长读长测序。

研究方法

将总人或小鼠脑组织RNA进行DNA酶处理并去除rRNA,然后用RNase R处理以消化线性RNA。为了进一步富集circRNA,将剩余的线性RNA多聚腺苷酸化(poly A tailing)并使用poly(A)纯化磁珠去除带polyA尾的RNA分子。收集富含circRNA的上清液并将其片段化(温和水解切口)以使circRNA线性化。从3’末端除去磷酸基团并在线性化RNA的5’末端添加磷酸基团后,对获得的RNA库进行多聚腺苷酸化,以与ONT测序方案一致。接下来进行ONT全长转录组建库。

研究结果

1、ONT circRNA测序方法

只有一小部分RNA是环状的(例如,小鼠神经系统中去rRNA的RNA库中仅占约0.1%)。作者采用上述方法进行circRNA-ONT测序,由于有些线性RNA分子对RNase R具有抗性,故而此方法比普通的去线性circRNA建库多了一步:将剩余的线性RNA多聚腺苷酸化(poly A tailing)并使用poly(A)纯化磁珠去除带polyA尾的RNA分子。结果表明,该步骤使circRNA强烈富集。

2、circRNA nanopore测序数据产出

北京赛车pk10投注人和小鼠circRNA文库的纳米孔测序分别产生0。67M和1。06M reads,其中3。2%和3。3%跨越circRNA BSJ(Back splice junction)位点。人和小鼠中分别鉴定到7,834和10,975个circRNA,其中1,319个在人和鼠中保守的circRNA。在最高表达和保守的circRNA中,发现众所周知的脑circRNA,例如circRims1、circRims2、circHipk3、circCdyl和circZfp609。整个数据集中,分别来自人和小鼠的2,945和7,052个circRNA先前未在circBase中注释。

两个高丰度circRNA:Hipk3和Zfp609(具有可变3’剪接位点的新型外显子)的外显子分布图分别显示在下图:

3、长读长测序全面绘制circRNA外显子-内含子组成

将所有小鼠和人跨越BSJ reads与各自的参考基因组比对,并定量比对到外显子或内含子区域的碱基对的数量。为了将分析集中于更丰富的circRNA中的内含子保留和其他可变剪接事件,仅进一步研究了具有10个或更多BSJ reads并具有高于3%的平均内含子百分比的circRNA。作者发现3个人和4个小鼠circRNA具有内含子保留,而39和57个circRNA包含分别在人和小鼠的RefSeq中未注释的外显子序列。CAMSAP1 是circRNA内含子保留实例,其仅发生在人RNA中;LPXN circRNA是仅在人中表达的circRNA。

可选择性外显子使用是人和小鼠circRNA中的普遍现象,circRNA的可变剪接模式通常在小鼠和人之间共享。circRNAs中使用的大多数外显子都在RefSeq中注释,但值得注意的是,人和小鼠表达良好的外显子(>5 reads)中1.9%(73个外显子)和2.1%(96个外显子)分别是新的、以前未在RefSeq中注释过。仅观察可变剪接的外显子,人和小鼠中新外显子的百分比分别增加到8.7%(21个外显子)和6.8%(12个外显子)。对于人circPPP6R2和circRBM23以及小鼠circBrsk2和circNrxn1(下图A-D)显示了广泛的可变剪接事件实例,其中circPPP6R2为包含未注释外显子的circRNA的实例。

4、circRNA新外显子使用进一步分析

将circRNA根据新外显子使用分类为“隐蔽的circRNA外显子”(与注释的外显子共享5’或3’剪接位点)或“独特的circRNA外显子”(全新的外显子)。人类2,393个外显子中的91个和小鼠中2,487个外显子中的82个是独特的circRNA外显子,140和163个分别是隐蔽的circRNA外显子。(所有单外显子circRNA都被排除在该分析之外,因为在单个read中需要完全覆盖检测到的外显子,这对于单个外显子circRNA而言在技术上是不可能的。)作者发现大多数独特的circRNA外显子在40-200bp范围内,但也经常观察到3-6bp的非常短的外显子(微外显子)组。有趣的是,大多数circRNA特异性外显子导致移码突变或终止密码子获得,可能解释了它们在线性mRNA翻译中缺失,因此受到无义介导降解。

小结

纳米孔测序技术提供了一种快速可靠的方法来绘制circRNA的特定外显子组成。

 

参考文献:

Rahimi K, Veno M T, Dupont D M, et al. Nanopore sequencing of full-length circRNAs in human and mouse brains reveals circRNA-specific exon usage and intron retention[J]. BioRxiv, 2019: 567164.

 

 

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